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β-內(nèi)酰胺類抗生素誘導(dǎo)革蘭氏陰性菌釋放內(nèi)毒素對(duì)其療效的影響
徐能武(解放軍第97醫(yī)院,　江蘇徐州221004) 袁建成　肖光夏　鄭江　秦孝建(重慶市西南醫(yī)院燒傷研究所,　重慶400038)

摘　要　

探討β-內(nèi)酰胺類抗生素在誘導(dǎo)革蘭氏陰性菌釋放內(nèi)毒素(LPS)及對(duì)感染動(dòng)物保護(hù)效能方面的差異,旨在為臨床上防治革蘭氏陰性菌感染時(shí)正確選擇抗生素提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

將Wistar大鼠背部做30%TBSA(Ⅲ°)燙傷,創(chuàng)面立即涂銅綠假單胞菌(PA103)懸液1ml(1× 109CFU),72h后制成大鼠燒傷創(chuàng)面膿毒癥模型。燒傷膿毒癥大鼠隨機(jī)分為單純抗生素治療組、半乳糖胺(GalN)敏化后治療組及愛蘭苔膠(CGN)封閉后治療組。分別用亞胺培南(IMP,5mg)和頭孢他啶(CTZ,10mg)單劑量腹腔注射(i.p.)治療,對(duì)照組施以等量無(wú)菌生理鹽水,同時(shí),敏化組加用GalN 50mg i.p.,以增強(qiáng)大鼠對(duì)LPS的敏感性,封閉組在敏化組的基礎(chǔ)上加用CGN 1mg i.p.,以阻斷LPS的生物學(xué)效應(yīng)。于抗生素治療前及治療后3、6及9h抽靜脈血,檢測(cè)血中細(xì)菌濃度,血漿LPS水平,并觀察敏化組和封閉組大鼠10d后的死亡率。結(jié)果IMP和CTZ均能使大鼠血中菌量顯著降低;IMP和CTZ在殺菌過(guò)程中均能誘導(dǎo)PA103釋放大量LPS,但CTZ組血漿LPS水平顯著超過(guò)相應(yīng)的IMP組(P <0.05或P <0.01);與此同時(shí),敏化組大鼠的死亡率CTZ組明顯高于IMP組(P <0.05),而在封閉組,兩者間的這種差異則消失(P>0.05)。

結(jié)果表明,同屬β-內(nèi)酰胺類的IMP和CTZ在殺菌功能方面并無(wú)差異,但在誘導(dǎo)細(xì)菌釋放LPS的能力方面CTZ> IMP;兩者間的這種差異直接影響到各自對(duì)感染動(dòng)物的保護(hù)效能,提示在臨床上防治革蘭氏陰性菌感染時(shí),選擇誘導(dǎo)細(xì)菌釋放較少LPS的抗生素(如IMP)可能更為合理。

關(guān)鍵詞 β-內(nèi)酰胺類抗生素;　革蘭氏陰性細(xì)菌;　內(nèi)毒素;　燒傷;　感染;　鱟試劑

　盡管廣譜抗生素的應(yīng)用,積極的液體復(fù)蘇,及時(shí)的血管活性藥物的支持和危重癥監(jiān)護(hù)水平在不斷提高,但革蘭氏陰性細(xì)菌的感染仍然是嚴(yán)重?zé)?、?chuàng)傷病人主要死亡原因之一[1,2]。革蘭氏陰性菌感染難治的主要原因是其釋放的內(nèi)毒素(LPS)啟動(dòng)機(jī)體不可逆轉(zhuǎn)的炎癥反應(yīng),促發(fā)膿毒癥或膿毒性休克,最終導(dǎo)致病人發(fā)生多器官功能損害或衰竭而死亡[2～ 4]。β-內(nèi)酰胺類抗生素歷來(lái)是防治革蘭氏陰性菌感染的重要手段,但國(guó)外近年來(lái)的研究表明[1,5,7～ 10],抗生素是把“雙刃劍” ,因?yàn)榭股卦跉缂?xì)菌的同時(shí)又誘導(dǎo)革蘭氏陰性菌釋放大量的LPS,而且這種誘導(dǎo)釋放的能力因抗生素的種類而異。由于LPS是燒傷膿毒癥及膿毒性休克發(fā)病機(jī)制中的啟動(dòng)因子,更為重要的是目前尚無(wú)一種確切有效而又可供臨床應(yīng)用的LPS拮抗劑,因此,各種抗生素誘導(dǎo)革蘭氏陰性菌釋放LPS能力的差異,必然最終影響其療效的優(yōu)劣。本實(shí)驗(yàn)選擇目前臨床上防治革蘭氏陰性菌感染最常用兩種抗生素亞胺培南(imipenem,IMP)和頭孢他啶(ceftazidime,CTZ),探討它們?cè)谥委煷笫鬅齻麆?chuàng)面膿毒癥時(shí)的殺菌效能,誘導(dǎo)LPS釋放,激活炎癥介質(zhì)產(chǎn)生,以及對(duì)感染動(dòng)物保護(hù)效能方面的異同,旨在為臨床上防治革蘭氏陰性菌感染時(shí)抗生素的選擇提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料和方法

1.1　材料

1. 1.1 細(xì)菌　銅綠假單胞菌PA103(Pseudomonasaeruginosa,PA103)第三軍醫(yī)大學(xué)附屬西南醫(yī)院燒傷研究所提供。

1.1.2　抗生素　亞胺培南(IMP),美國(guó)Merck Sharp& Dohme公司,批號(hào)V5134;頭孢他啶(CTZ),英國(guó)Glaxo Wellcome公司,批號(hào)B4166GA。

1.1.3　動(dòng)物　 Wistar大鼠,體重200± 20g,雌雄不限,第三軍醫(yī)大學(xué)外研所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.4　試劑　鱟試儀專用鱟試劑,廈門鱟試劑廠,批號(hào)980225;鱟試劑溶解水,廈門鱟試劑廠,批號(hào)980125。 D-半乳糖胺(D-galactosamine,GalN)美國(guó)Sigma公司,批號(hào)117H3911。愛蘭苔膠(carrageenan,CGN),美國(guó)Sigma公司,批號(hào)127H1222。腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)及白介素6(interleu-kine-6,IL-6)放免藥盒,北京東亞免疫技術(shù)研究所提供。Griess試劑:第三軍醫(yī)大學(xué)附屬西南醫(yī)院燒傷研究所提供。

1.1.5　儀器　紫外分光光度計(jì) 自動(dòng)γ-計(jì)數(shù)儀:放射免疫γ-計(jì)數(shù)儀 內(nèi)毒素自動(dòng)分析儀 熒光顯微鏡: Olympus

1.2　方法

1.2.1　去熱原處理　三角錐瓶、玻璃試管、橡皮塞、吸頭,EP管等清洗干凈后60℃烘干,各自分裝后送鈷-60照射徹底去熱原。

1.2.2　 PA103懸液制備　將PA103劃線接種于血瓊脂平板,37℃孵育24h,挑取單菌落轉(zhuǎn)移到普通牛肉浸膏培養(yǎng)液中,置水浴恒溫振蕩器中37℃水浴振蕩培養(yǎng)18～ 20h(頻率60次/min)。培養(yǎng)液3000r/min離心15min,棄除上清,無(wú)菌生理鹽水洗滌,再次離心棄除上清,重復(fù)洗滌1次后用無(wú)菌生理鹽水配成細(xì)菌濃度為1× 109CFU/ml的細(xì)菌懸液(光鏡計(jì)數(shù)法),異硫氰熒光素標(biāo)記后,置4℃冰箱備用。

1.2.3　大鼠燒傷創(chuàng)面膿毒癥模型制作[11]　按文獻(xiàn)[11]進(jìn)行。

1.2.4　動(dòng)物分組及處理

單純抗生素治療組　將大鼠隨機(jī)(隨機(jī)表法)分為IMP治療組、CTZ治療組和對(duì)照組,每組大鼠24只?？股亟o藥方案: IMP 5mg /rat,CTZ 10mg /rat,燙傷及涂菌后72h腹腔注射,對(duì)照組注射等量無(wú)菌生理鹽水。

半乳糖胺敏化及抗生素治療組　將大鼠隨機(jī)分為IMP+ GalN組、CTZ+ GalN組和GalN+ saline組,每組大鼠10～ 12只?？股亟o藥方案同前,GalN50mg /rat,抗生素治療前1h腹腔注射。愛蘭苔膠封閉,半乳糖胺敏化及抗生素治療組　將大鼠隨機(jī)分為IMP+ GalN+ CGN組、CTZ+ GalN+ CGN組和GalN+ CGN+ saline組,每組10～ 12只大鼠?？股刂委熀?span style="font-size: 16px; font-family: Calibri;">GalN敏化同前,CGN 1mg /rat,抗生素治療前2d腹腔注射。

1.2.5　時(shí)相點(diǎn)設(shè)置和標(biāo)本采集　共設(shè)置4個(gè)時(shí)相點(diǎn),0h(抗生素治療前)和抗生素治療后3、6及9h,每個(gè)時(shí)相點(diǎn)6只大鼠。大鼠麻醉后剖腹,直視下腔靜脈穿剌采血,取血漿置于去熱原EP管中,-36℃貯存待測(cè)。

1.2.6　觀察指標(biāo)與檢測(cè)方法

細(xì)菌定量培養(yǎng)及菌種鑒定　取抗凝下腔靜脈血100μl,無(wú)菌生理鹽水10倍稀釋后再取100μl于普通血瓊脂平板,L棒均勻涂布,37℃孵箱培養(yǎng)24h行菌落計(jì)數(shù),并用熒光顯微鏡檢鑒定菌種是否為種植菌PA103。

LPS測(cè)定　采用動(dòng)態(tài)濁度法[12],在BET-16細(xì)菌內(nèi)毒素測(cè)定儀上進(jìn)行。血漿TNF和IL-6測(cè)定　血漿標(biāo)本在室溫下解凍,測(cè)定用放免法,在自動(dòng)γ計(jì)數(shù)儀上進(jìn)行,操作按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

血漿NO測(cè)定　采用Griess法[13]。

死亡率觀察　分別觀察IMP+ GalN組,CTZ+GalN組,GalN+ saline組,IMP+ GalN+ CGN組,CTZ+ GalN+ CGN組,GalN+ CGN+ saline組大鼠的死亡率,觀察期限為燙傷及涂菌后13d。

1.2.7　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理　采用華西醫(yī)科大學(xué)PEMS醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)程序軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,檢驗(yàn)水準(zhǔn)α定為0.05和0.01。

2　結(jié)果

2.1　抗生素治療后血中細(xì)菌菌量變化

燙傷及創(chuàng)面涂菌后3d,大鼠血中菌量達(dá)103～105CFU/ml。未用抗生素的對(duì)照組在各時(shí)相點(diǎn)菌量居高不下,而抗生素治療后各時(shí)相點(diǎn)血中菌量迅速減少,至用藥后9h血培養(yǎng)已轉(zhuǎn)陰,且IMP和CTZ殺菌效能相似,治療組各時(shí)相點(diǎn)血中細(xì)菌數(shù)量與對(duì)照組相比差異非常顯著(P<0.01,Fig.1)。

2.2　血中內(nèi)毒素水平變化

未治療組各時(shí)相點(diǎn)血漿LPS水平變化不明顯;IMP治療后各時(shí)相點(diǎn)血漿LPS逐漸升高,至9h達(dá)峰值,其中的3h及9h與治療前及未治療組同時(shí)相點(diǎn)相等比升高尤為明顯;與上述不同,CTZ治療后血漿LPS水平升高迅速而顯著,各時(shí)相點(diǎn)與用藥前及未治療組和IMP治療組同時(shí)相點(diǎn)相比差異顯著或非常顯著(P<0.05或P<0.01,Fig.2)。

2.3　血漿TNF的變化

未用抗生素治療組(saline組)血漿TNF水平呈緩慢降低趨勢(shì),但各時(shí)相點(diǎn)差異不顯著(P> 0.05);IMP治療組各時(shí)相點(diǎn)血漿TNF變化不顯著,與用藥前比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05);與上述不同,CTZ治療組用藥后各時(shí)相點(diǎn)血漿TNF水平升高,尤以3h最為明顯,與治療前及對(duì)照組和IMP組同時(shí)相點(diǎn)相比差異顯著(P<0.05,Fig.3)。

2.4　血漿IL-6水平變化

2.4.1　未用抗生素治療的對(duì)照組　血漿IL-6水平變化小,各時(shí)相點(diǎn)間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(Fig.4)。

2.4.2　抗生素治療組　 IMP治療后血漿IL-6水平緩慢上升,至9h升幅最大,與治療前及對(duì)照組同時(shí)相點(diǎn)相比有顯著差異(P <0.05),CTZ治療后血漿IL-6水平升高的速度快,幅度大,其6、9h兩時(shí)相點(diǎn)與治療前及對(duì)照組和IMP組同時(shí)相點(diǎn)相比,均有非常顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01,Fig.4)。

2.5　血漿NO變化2.5.1　未用抗生素治療的對(duì)照組　血漿NO水平在各時(shí)相點(diǎn)無(wú)顯著變化(Fig.5)。

2.5.2　抗生素治療組　 IMP治療后血漿NO水平呈逐漸升高趨,9h升幅最大,3、6、9h 3個(gè)時(shí)相點(diǎn)與生理鹽水對(duì)照組同時(shí)相點(diǎn)相比,均有顯著或非常顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P <0.05或P <0.01);CTZ治療后6h血漿NO水平開始升高,9h升幅最大,與治療前及生理鹽水對(duì)照組和IMP組同時(shí)相點(diǎn)相比,升高更為明顯,有非常顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01,Fig.5)。

2.6　大鼠死亡率

2.6.1　敏化組大鼠死亡率　 3組中CTZ+ GalN組死亡率最高,GalN+ saline組次之,IMP+ GalN組最低,兩抗生素治療組之間的差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P <0.05,Tab.1)。

2.6.2　封閉組大鼠死亡率　經(jīng)CGN封閉單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)后,各抗生素治療組死亡率降低,與對(duì)照組(GalN+ CGN+ saline組)相比,差異顯著(P <0.05),而CTZ和IMP組之間原先的差異消失(P> 0.05,Tab.2)。

2.7　相關(guān)分析

IMP治療的各組大鼠血中各種炎癥介質(zhì)水平與LPS水平呈顯著正相關(guān),CTZ治療組更是如此。相關(guān)分析結(jié)果見Tab.3。

3　討論

3.1　抗生素種類對(duì)誘導(dǎo)革蘭氏陰性菌釋放LPS的影響

近十年來(lái)國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn),不同種類的抗生素在誘導(dǎo)革蘭氏陰性菌釋放LPS能力上存在差異[1,3～ 5,7,8]。我們的研究結(jié)果表明:同屬β-內(nèi)酰胺類的IMP和CTZ在治療銅綠假單胞菌PA103燒傷大鼠創(chuàng)面膿毒癥時(shí)均能誘導(dǎo)細(xì)菌釋放大量LPS,但無(wú)論釋放的數(shù)量,還是釋放的速度,CTZ都遠(yuǎn)超過(guò)IMP,兩者差異非常顯著(P<0.01,Fig.2)。提示IMP可能在治療燒傷后革蘭氏陰性菌感染時(shí)會(huì)誘導(dǎo)較少的內(nèi)毒素釋放,從而對(duì)防止或減輕致死性的內(nèi)毒素血癥有益。不同抗生素在誘導(dǎo)革蘭氏陰性菌釋放LPS能力上的差異,與其對(duì)細(xì)菌胞壁上不同青霉素結(jié)合蛋白(Penicillin Binding Proteins,PBPs)的親和性有關(guān)。國(guó)外研究已證實(shí)[1,10]:凡是與PBP3親和性高的抗生素,可誘導(dǎo)細(xì)菌產(chǎn)生絲狀改變,釋放較多的LPS,原因是此類抗生素可抑制細(xì)菌分裂,而細(xì)菌胞壁不斷生長(zhǎng)延長(zhǎng)從而導(dǎo)致LPS不斷釋放。而與PBP2親和性高的抗生素,誘導(dǎo)細(xì)菌產(chǎn)生球狀變,由于球狀體比同等質(zhì)量的柱狀體幾何面積小,加之球狀體胞壁合成受抑,從而導(dǎo)致LPS合成和釋放減少。 IMP屬于PBP2高親和性,CTZ屬于PBP3高親和性,這是兩者在誘導(dǎo)革蘭氏陰性菌釋放LPS能力差異的根本原因。

3.2　血中LPS水平與炎癥介質(zhì)水平間的關(guān)系

國(guó)內(nèi)外學(xué)者已公認(rèn): LPS是致死性炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的啟動(dòng)因子之一[2],抗生素對(duì)革蘭氏陰性菌的快速殺菌作用導(dǎo)致內(nèi)毒素大量釋放和產(chǎn)生TNF[6]。 TNF、IL-6和NO等則是介導(dǎo)膿毒癥及膿毒性休克發(fā)生和發(fā)展的重要介質(zhì)[3],LPS釋放、炎癥介質(zhì)產(chǎn)生、膿毒癥及膿毒性休克發(fā)生和發(fā)展是三位一體的關(guān)系[14]。我們的研究結(jié)果及相關(guān)分析表明:與IMP相比,CTZ治療大鼠燒傷創(chuàng)面膿毒癥時(shí),血中LPS、TNF及IL-6和NO水平較高(Fig.2～ 5),高水平的LPS與高水平的炎癥介質(zhì)之間關(guān)系密切(Tab.3),提示在治療膿毒癥及膿毒性休克時(shí)應(yīng)盡量避用誘導(dǎo)革蘭氏陰性菌釋放較多LPS的抗生素(如CTZ)。

3.3　抗生素誘導(dǎo)革蘭氏陰性菌LPS釋放與抗生素療效間的關(guān)系

為了進(jìn)一步探討IMP和CTZ在誘導(dǎo)LPS釋放及炎癥介質(zhì)產(chǎn)生方面差異的病理生理學(xué)意義,我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中設(shè)計(jì)了對(duì)燒傷膿毒癥大鼠的敏化實(shí)驗(yàn)和封閉實(shí)驗(yàn)。半乳糖胺(GalN)是一種可逆性肝細(xì)胞毒性物質(zhì),通過(guò)抑制肝細(xì)胞蛋白質(zhì)合成來(lái)阻斷肝臟的解毒功能,可顯著提高大鼠對(duì)LPS的敏感性[13]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:經(jīng)GalN敏化的CTZ治療組大鼠的死亡率遠(yuǎn)高于敏化后IMP治療組的死亡率,兩者差異非常顯著(P <0.01,見Tab.1)。愛蘭苔膠(CGN)是一種從海藻中提取的多糖類化合物,可選擇性封閉肝臟及腹腔單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)對(duì)LPS的生物學(xué)效應(yīng),減少TNF及IL-6等炎性介質(zhì)的產(chǎn)生。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),預(yù)先用CGN封閉后,同樣敏化的燒傷創(chuàng)面膿毒癥大鼠死亡率明顯降低,而且,IMP和CTZ治療組間的差異消失(Tab.2),這進(jìn)一步說(shuō)明:盡管IMP和CTZ殺菌功能相同,但由于各自誘導(dǎo)革蘭氏陰性菌釋放LPS及激活炎癥介質(zhì)產(chǎn)生的能力不同,結(jié)果導(dǎo)致對(duì)感染動(dòng)物的保護(hù)效能也不同,提示抗生素誘導(dǎo)革蘭氏陰性菌釋放LPS的能力對(duì)其療效有直接影響。

簡(jiǎn)言之,根據(jù)我們的研究得出如下初步結(jié)論:

(1)同屬β-內(nèi)酰胺類的IMP和CTZ在對(duì)銅綠假單胞菌PA103殺菌效能方面并無(wú)明顯差異;

(2)IMP和CTZ在殺菌的同時(shí)可誘導(dǎo)革蘭氏陰性菌釋放大量的LPS,釋放能力CTZ>IMP;

(3)過(guò)量的LPS與高水平炎癥介質(zhì)(如TNF、IL-6及NO等)的產(chǎn)生關(guān)系密切;

(4)IMP和CTZ在誘導(dǎo)革蘭氏陰性菌釋放LPS方面的差異,直接影響到各自對(duì)感染動(dòng)物的保護(hù)效能;

(5)由于上述原因,故在臨床上治療革蘭氏陰性菌感染所致的膿毒癥或膿毒性休克時(shí),選擇誘導(dǎo)細(xì)菌釋放較少LPS的抗生素(如IMP)可能更為合理。

參考文獻(xiàn)（略）

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